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VPH et cancer I Cycle réplicatif du VPH I Génome et protéines du VPH I Réplication de l'ADN du VPH I Inhibiteurs du VPH

VPH et cancer
Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin qui induisent des lésions bénignes et malignes de l’épithélium différencié de la peau et des muqueuses. Certains types de VPH à « risque élevé » comme le VPH16, -18, -31 ou -45 sont la cause du cancer du col utérin, la 2ème forme de cancer la plus répandue chez les femmes à travers le monde. Aux États-Unis 13 000 nouveaux cas de cancer du col sont diagnostiqués chaque année se soldant par environ 4000 décès. Bien qu’une infection par un type de VPH à « risque élevé » est une cause nécessaire au développement du cancer, elle n’est pas suffisante. L’état du système immunitaire, l’utilisation de contraceptifs, le tabagisme, et la persistance de l’infection sont d’autres facteurs qui peuvent influencer le développement du cancer suite à l’infection virale. Les infections par des VPH à « faible risque » (types -6 et -11) sont associées au développement de verrues génitales (condylomes) qui se manifestent cliniquement chez 1 % de la population sexuellement active. Leur incidence est donc très importante, mais celles-ci ne mettent pas la vie de la personne atteinte en danger. Les traitements utilisés actuellement pour soigner les lésions associées au VPH sont surtout de type ablatif ou cherchent à détruire les cellules infectées; l’application topique de l’immunomodulateur imiquimod sur les verrues génitales est aussi utilisée. Malheureusement, il n’existe pas actuellement de traitement antiviral qui éliminerait le virus. (Voir figure 1). 
Cliquez ici pour avoir plus d’informations sur le VPH et le cancer. (en anglais seulement)


Cycle réplicatif du VPH
Le cycle réplicatif du VPH est dépendant du phénomène de différenciation cellulaire qui se déroule dans l’épithélium, ce qui rend impossible la culture de ces virus in vitro autrement que dans des cultures de type organotypique (raft). Ces virus infectent la couche des cellules basales où ils établissent leur génome d’ADN à double brin sous la forme d’un élément extra-chromosomique circulaire (épisome) dans leurs noyaux. Le maintien du génome viral en 50-100 copies par cellule basale infectée est un aspect essentiel du cycle réplicatif viral et est nécessaire à l’induction des pathologies associées à l’infection. Voilà pourquoi l’idée d’interférer avec ce processus est considérée comme une stratégie intéressante pour le développement d’un agent antiviral. Dans les couches supérieures de l’épithélium, le génome viral est amplifié à plus de 1000 copies. C’est aussi dans ces couches supérieures que les protéines de la capside sont exprimées et que les virions sont assemblés et éventuellement relâchés. (Voir figure 2)


Génome et protéines du VPH
Les petits génomes circulaires d’ADN double brin de tous les types de VPH sont organisés de façon similaire. Ils codent pour seulement quelques protéines; 6 protéines précoces et 2 protéines tardives. (Voir figure 3)

E1 et E2 : E1 et E2 sont les 2 protéines virales requises pour la réplication de l’ADN viral, de concert avec la machinerie de réplication de l’ADN de la cellule hôte.

E4 et E5 : Ces 2 protéines sont nécessaires pour l’amplification du génome viral dans les couches supérieures de l’épithélium.

E6 et E7 : Les protéines E6 et E7 des types de VPH à « risque élevé » sont oncogéniques. Elles sont capables d’immortaliser les cellules et induisent chez elles une instabilité génomique. E6 et E7 rendent inactives les protéines cellulaires p53 et Rb, respectivement, qui sont responsables de la suppression de tumeurs.

L1 et L2 : Ces 2 protéines forment la capside virale; elles sont exprimées tardivement lors de l’infection, dans les couches supérieures de l’épithélium.

LCR (« -control-region ») : Cette région contient la plupart des séquences d’ADN régulatrices nécessaires à la réplication du génome viral (origine de réplication) et à l’expression des gènes viraux (promoteur).


Réplication de l’ADN du VPH
Les protéines virales E1 et E2 sont nécessaires à la réplication de l’épisome du VPH et agissent de concert avec la machinerie de réplication de l’ADN de l’hôte. E1 agit à la fois comme une protéine qui se fixe à l’ADN pour reconnaître l’origine virale et subséquemment comme hélicase pour dérouler l’ADN en amont de la fourche de réplication. Un modèle de l’assemblage de E1 à l’origine apparaît ci-dessous. Les études au plan structural et fonctionnel indiquent que E1 est une protéine modulaire composée d’un domaine enzymatique C-terminal ayant une activité ATPase/hélicase (en vert), d’un domaine central se liant de façon spécifique à l’ADN (en rouge) et d’un domaine régulateur N-terminal (n’apparaissant pas). E1 se fixe à l’ADN de façon spécifique. In vitro et in vivo, la liaison de E1 spécifiquement à l’origine est facilitée par son interaction avec E2 (en bleu), un facteur de transcription/réplication qui se lie à certaines séquences de l'origine avec une haute affinité. La formation d’un complexe ternaire entre E1, E2, et l’origine sert de point d’ancrage pour l’assemblage d'un complexe E1 de plus grande taille, probablement un double-hexamère nécessaire pour le déroulage bidirectionnel de l'ADN. E1 interagit avec certains facteurs cellulaires de réplication, entre autres la polymérase alpha-primase et la protéine RPA, une protéine liant l’ADN simple brin, afin de promouvoir la réplication de l’ADN viral et venir faciliter l’ouverture du double brin. (Voir figure 4 : adapté de Titolo et al., 2003, J Virol.77 : 5178-5191)


Inhibiteurs du VPH - De petites molécules inhibitrices de la réplication de l’ADN du VPH
Des recherches faites chez Boehringer Ingelheim (Canada) Ltée / Recherche et Développement ont mené à l’identification de la première petite molécule inhibitrice de la réplication de l’ADN du VPH. La caractérisation de son mécanisme d’action a montré que cette classe d’inhibiteur se lie à E2 et bloque son interaction avec l’hélicase E1. Ces inhibiteurs ont défini sur E2 une région capable de lier de petites molécules. Cette région de E2 auparavant inconnue a maintenant été caractérisée par cristallographie à rayons X (voir ci-dessous). Il a été démontré que cette classe d’inhibiteurs prévient spécifiquement l’interaction E1-E2 in vivo et de ce fait inhibe la réplication de l’ADN du VPH dans les cellules où se développe l’infection. Ces résultats mettent en lumière pour la première fois le potentiel de l’interaction E1-E2 comme cible anti-virale pour le traitement des infections par le VPH. Ces inhibiteurs sont aussi un rare exemple d’une classe de petites molécules capables de bloquer une interaction protéine-protéine.

Voir figure 5 : A) Vue en stéréo du complexe inhibiteur-TAD. B) Vue en stéréo de la surface moléculaire du TAD du VPH11 montrant 2 molécules inhibitrices y étant arrimées. Les acides aminés qui forment la poche capable de lier les petites molécules sont de couleur magenta. Les sphères jaunes correspondent aux endroits du site de liaison où des atomes du ligand interagissent de façon particulièrement favorable avec la protéine, selon des prédictions computationnelles. Tiré de Wang et al., 2004, J Biol Chem, 279 : 6976-6985.

HPV and cancer I HPV Life Cycle I HPV Genome and ProteinsHPV DNA ReplicationHPV Inhibitors

HPV and cancer
Human papillomaviruses (HPVs) are small double stranded DNA viruses that induce benign and malignant hyperproliferative lesions of the differentiating epithelium. Notably, infection by a “high-risk” HPV type such as HPV16, -18, -31 or -45 is a necessary cause for the development of cervical cancer, the second most common cancer in women worldwide. Approximately 13,000 new cases of cervical cancer are diagnosed each year in the US, resulting in about 4000 deaths. Although infection by a high-risk HPV type is necessary for the development of cervical cancer, it is not sufficient. Several factors including immune status, use of contraceptive, cigarette smoking and persistence of the infection, are known to promote cancer development. Infection by "low-risk" HPVs (types -6 and -11) is associated with the development of genital warts (condylomas). Although not life-threatening, genital warts are very common, being clinically apparent in 1% of the sexually active population. Current therapies for HPV-associated lesions are mostly ablative and cytodestructive in nature, although genital warts can be treated by topical application of the immunomodulator imiquimod. Importantly, there is currently no antiviral drug for the treatment of HPV infections. (See Figure 1). 
Follow this link to find out more about HPV and cancer.


HPV Life Cycle
The life cycle of HPV is coupled to the cellular differentiation program that occurs in the epithelium, a fact that has prevented growing these viruses in vitro other than in organotypic (raft) cultures. These viruses infect the basal cell layer where they establish their double stranded DNA genome as a circular extra-chromosomal element in the nucleus of infected cells. Maintenance of the viral genome at 50-100 copies per infected basal cell is central to the viral life cycle and its associated pathologies. Hence, interfering with this process has been considered a valuable strategy for the development of antiviral drugs. In the upper layers of the epithelium, the viral genome is amplified to greater than 1000 copies. It is also in these upper layers that the capsid proteins are expressed and that virions are assembled and eventually shed off. (See Figure 2)


HPV Genome and Proteins
The small circular double stranded DNA genomes of all HPV types are organized similarly. They encode only a few gene products; 6 early (E) and two late (L) proteins. (See Figure 3)

E1 and E2: E1 and E2 are the two viral proteins that are required for viral DNA replication, together with the host cell DNA replication machinery.

E4 and E5: These two proteins are needed for amplification of the viral genome in the upper layers of the epithelium.

E6 and E7: The E6 and E7 proteins of high-risk HPV types are oncogenic. They cooperate to immortalize cells and also induce genomic instability. E6 and E7 abrogate the activity of the cellular tumor suppressor proteins p53 and Rb, respectively. E6 also increases telomerase activity.

L1 and L2: These two proteins form the viral capsid; they are expressed late in infection, in the upper layers of the epithelium.

LCR: The long-control-region (LCR) contains most of the regulatory DNA sequences needed for proper replication of the viral genome (origin of DNA replication) and for the expression of the viral genes (enhancer and promoter regions).

HPV DNA Replication
The HPV episome is replicated by the viral E1 and E2 proteins together with the host DNA replication machinery. E1 acts both as a DNA binding protein to recognize the viral origin and subsequently as a helicase to unwind the DNA ahead of the replication fork. A model of the assembly of E1 at the origin is shown below. Structure-function studies have indicated that E1 is a modular protein comprised of a C-terminal enzymatic domain with ATPase/helicase activity (shown in green), an origin DNA-binding domain located in the center of the protein (red) and an N-terminal regulatory domain (not shown). E1 binds to DNA with little sequence specificity. In vitro and in vivo, binding of E1 specifically to the origin is facilitated by its interaction with E2 (blue), a transcription/replication factor that binds with high affinity to sites in the viral origin. Assembly of a ternary complex between E1, E2 and the origin serves as a starting point for the assembly of a larger E1 complexe that has unwinding activity, most likely a double hexamer necessary for bidirectional unwinding. E1 interacts with DNA replication factors, including the polymerase α-primase and the single-stranded binding protein RPA, to promote viral DNA replication. (See Figure 4, adapted from Titolo et al., 2003, J Virol, 77:5178-5191)


HPV Inhibitors - Small molecule inhibitors of HPV DNA replication
Research performed at Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. / Research and Development led to the identification of the first small molecule inhibitors of HPV DNA replication. Characterization of their mechanism of action showed that this class of inhibitors binds to E2 and prevents its interaction with the E1 helicase. These inhibitors defined a previously unrecognized small-molecule binding pocket on E2, which has now been characterized by X-ray crystallography (see below). This class of inhibitors was found to antagonize specifically the E1-E2 interaction in vivo and to inhibit HPV DNA replication in transiently transfected cells. These results highlighted for the first time the potential of the E1-E2 interaction as a small molecule antiviral target for the treatment of HPV infections. These inhibitors also provided a rare example of a class of small molecules that can antagonize a protein-protein interaction.

See Figure 5: A) Stereo view of the TAD-inhibitor complex. B) Stereo view of the molecular surface of the HPV11 TAD with two bound inhibitor molecules. Amino acids that comprise this small molecule binding pocket are shown in magenta Spheres corresponding to locations within the binding site where ligand atoms are predicted by computational methods to make particularly favorable interactions with the protein are shown in yellow. From Wang et al., 2004, J Biol Chem, 279:6976-6985.

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