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Fig. 1: Une représentation schématique de la différenciation de cellules hématopoïétiques adaptée de Akashi et Weissman.LT-HSC : cellule souche hématopoïétique à long terme, ST-HSC : cellule souche hématopoïétique à court terme, MPP : progéniteur multipotent, CLP : progéniteur lymphoïde commun, CMP : progéniteur myéloïde commun, GMP : progéniteur polynucléaire/monocytique, MEP : progéniteur mégacaryocytique/érythroïde. On peut y voir les différentes lignées hématopoïétiques ainsi que les types de cellules représentatifs. Les étapes où Gfi1, Gfi1b, c-Myc ou Pim-1 jouent un rôle régulateur sont indiquées. Pour références, consulter : Möröy T, Int J Biochem Cell Biol. 2005, 37(3): 541. Bachmann & Möröy. Int J Biochem Cell Biol. 2005, 37(4): 726. Wilson & Trumpp. Nat Rev Immunol. 2006, 6(2): 93.
Fig. 2: Les protéines Gfi1 et Gfi1b portent chacune deux domaines : un domaine qui fixe l’ADN C terminal comprenant six motifs (en bleu) en doigts de zinc de type C2H2.Au N-terminal, les deux protéines Gfi1 portent un domaine (en vert) d’acide aminée 20 SNAG qui est conservé parmi un certain nombre de protéines en doigts de zinc semblables et qui médient l’activité du répresseur des protéines Gfi1 et Gfi1b. La zone entre ces deux domaines n’est pas conservée entre les deux protéines.
Fig. 3: Le pre-mRNA CD45 peut être épissé de façon alternative produisant une augmentation de la forme CD45RB ou CD45RO, respectivement.Le petit facteur d’épissage U2AF26 et la protéine en doigt de zinc Gfi1 peuvent influencer ce processus d’épissage alternatif en facilitant l’exclusion et l’inclusion de l’exon 5 (rouge), respectivement.
Fig. 1: Schematic representation of hematopoietic cell differentiation adapted from Akashi and Weissman.LT-HSC: long term hematopoietic stem cell, ST-HSC: short-term hematopoietic stem cell, MPP: multi potent progenitor, CLP: common lymphoid progenitor, CMP: common myeloid progenitor, GMP: granulo/monocytic progenitor, MEP: megakaryocytic/erythroid progenitor. Shown are the different hematopoietic lineages and representative cell types. The steps where Gfi1, Gfi1b, c-Myc or Pim-1 have regulatory roles are indicated. For references see: Möröy T, Int J Biochem Cell Biol. 2005, 37(3): 541. Bachmann & Möröy. Int J Biochem Cell Biol. 2005, 37(4): 726. Wilson & Trumpp. Nat Rev Immunol. 2006, 6(2): 93.
Fig. 2: The Gfi1 and Gfi1b proteins each bear two domains: a C-terminal DNA binding domain comprising six C2H2 type zinc finger motifs (blue).At the N-terminus both Gfi1 proteins carry a 20 amino acid SNAG domain (green) that is conserved among a number of similar zinc finger proteins and mediates the repressor activity of Gfi1 and Gfi1b. The region between these domains is not conserved between the two proteins.
Fig. 3: The CD45 pre mRNA can be alternatively spliced giving rise to the CD45RB or CD45RO form, respectively.The small splice factor U2AF26 and the zinc finger protein Gfi1 can influence this alternative splicing process by facilitation the exclusion of inclusion of exon 5 (red), respectively.
Projects

Cellules souches dans l’hématopoïèseCancer dans le système hématopoïétiqueModificateurs de chromatine I Régulation de l’épissage alternatifComplexe Miz-1/c-Myc dans l’hématopoïèse

Cellules souches, autorenouvellement et détermination de la lignée dans l’hématopoïèse
Afin d’assurer la continuité de la reproduction de toutes cellules sanguines et immunitaires au cours de la durée de vie d’un individu, un pool autorenouvelé de cellules souches hématopoïétiques est requis. Cependant, ces cellules souches sont non seulement capables de s’autorenouveler, mais elles ont également la capacité de se différencier et de produire des progéniteurs multipotents ainsi qu’une série de progéniteurs dédiés à la lignée intermédiaire capables de générer des lignées spécifiques de cellules hématopoïétiques ou immunitaires. Au cours de ce processus de différenciation, les cellules souches perdent graduellement leur capacité d’autorenouvellement, c’est-à-dire leur « aspect souche » et acquièrent de nouveaux phénotypes caractérisés par un degré plus élevé de consécration à la lignée. La décision des cellules souches hématopoïétiques ou de leur progéniture plus consacrées, de s’autorenouveler ou de se différencier, est strictement contrôlée par des mécanismes à la fois extrinsèques et intrinsèques.

Le cancer dans le système hématopoïétique
La différenciation hématopoïétique est contrôlée par de nombreuses voies de signalisation qui peuvent être initiées par les interleukines, par des facteurs de croissance très spécifique ou leurs récepteurs, et ils sont relayés par des protéines adaptateurs cytoplasmiques, des kinases et d’autres facteurs cytoplasmiques latents. Plusieurs de ces voies de signalisation aboutissent éventuellement dans le noyau où elles activent les facteurs de transcription et les régulateurs de chromatine, qui transduisent les signaux dans une modulation de l’expression génétique. Le lymphome et la leucémie peuvent être considérés comme une conséquence d’une différenciation hématopoïétique aberrante causée par le dérèglement de constituants particuliers de ces voies de signalisation. Notre groupe s’intéresse au décodage de la programmation génétique altérée dans les malignités hématopoïétiques et à l’identification des mécanismes sous-jacents qui en sont responsables. Pour atteindre ce but, nous étudions les facteurs de transcription qui sont l’aboutissement des voies de signalisation hématopoïétiques et qui ont été mêlés à l’émergence de la leucémie et du lymphome. Les facteurs de transcription qui font actuellement l’objet d’une investigation dans notre laboratoire sont les protéines en doigts de zinc Gfi1 et Gfi1b, la protéine basique hélice-boucle-hélice c-Myc et un de ses partenaires, le facteur de transcription Miz-1 du domaine POZ/BTB. Ce qui est intéressant c’est que pour les modèles de lymphome murin, les protéines c-Myc et Gfi1 peuvent agir en synergie dans la génération de néoplasmes lymphoïdes et la protéine c-Myc est capable de coopérer avec une kinase sérine/thréonine appelée Pim-1 pour accélérer la formation de tumeurs chez les souris. De ce fait, la kinase Pim-1 fait également partie de notre programme de recherche. (Voir figure 1)

Gfi1 et Gfi1b – modificateurs de chromatine dans la différenciation des cellules hématopoïétiques
Les Gfi1 et Gfi1b sont de petites protéines en doigt de zinc ayant une masse moléculaire de 55 et 37 kDa, respectivement. Les deux fonctionnent dans le noyau en tant que silenceurs transcriptionnels à des étapes précises durant la différenciation hématopoïétique, vraisemblablement en altérant la configuration de la chromatine. Tandis que la protéine Gfi1 est mêlée au développement des cellules myéloïdes et lymphoïdes, la protéine Gfi1b quant à elle est responsable de la maturation des cellules érythroïdes et des mégacaryocytes. Afin d’étudier le rôle de la Gfi1 et de son homologue plus petit, la Gfi1b, nous avons généré des souris mutantes par ciblage de gènes. Nous avons été très surpris de découvrir qu’un manque de Gfi1 provoque une grave neutropénie et un blocage développemental de la granulopoïèse. Ce blocage développemental est intrinsèque à la lignée hématopoïétique puisque les souris congéniques irradiées auxquelles on a transplanté de la moelle osseuse carencée en Gfi1 démontrent le même défaut de différenciation, ce qui suggère que la protéine Gfi1 contrôle l’implication des cellules progénitrices pour ce qui est de la différenciation granulo monocytique. Dans la poursuite de notre investigation, nous avons utilisé des souris carencées en Gfi1 et nous avons ainsi pu déceler les rôles que joue la Gfi1 dans la différenciation de la cellule-T, dans la réponse immunitaire innée et aussi dans les cellules souches hématopoïétiques. À l’opposé de la protéine Gfi1, la protéine Gfi1b qui s’y rattache semble être responsable d’une maturation correcte des cellules érythroïdes et des mégacaryocytes. Si on compare le modèle d’expression et les implications fonctionnelles des deux protéines durant l’hématopoïèse, on a l’impression que les deux facteurs ont été conçus pour accomplir des tâches similaires de différenciation de cellules hématopoïétiques dans des lignées de cellules différentes. La façon dont les protéines Gfi1 et Gfi1b agissent sur le niveau moléculaire de la chromatine pour médier leur tâche dans la différenciation hématopoïétique, est actuellement à l’étude par notre groupe. http://www.chromatin-plasticity.org. (Voir figure 2)

Régulation de l’épissage alternatif au moyen de la coopération entre la Gfi1 et le facteur d’épissage U2AF26
L’épissage alternatif survient lorsque des molécules de pre-mRNA identiques sont épissées non seulement en un mais en plusieurs transcrits matures différents avec potentiel différent de codage de protéines. On estime que plus de 50 % des gènes humains sont sujets à l’épissage alternatif. Le nombre potentiellement très élevé d’isoformes de protéine qui peuvent être générés par ce processus d’épissage alternatif représente une source importante de la diversité du protéome. L’épissage alternatif non seulement augmente le nombre de protéines encodées par un génome donné mais il représente un processus régulateur pour contrôler l’expression de protéines fonctionnellement diverses à partir de simples gènes. Cette diversité fonctionnelle peut varier avec le développement du stade de différenciation d’une cellule ou peut dépendre des stimuli externes. Un exemple paradigmatique est la tyrosine phosphatase transmembrane CD45 qui est requise pour l’activation de la cellule T dépendante de l’antigène. Le pre-mRNA CD45 subit un épissage alternatif pour produire huit isoformes différents dans des cellules T, selon leur stade de développement et l’état de l’activation. Deux points n’ont pas été élucidés: de quelle manière ce processus est contrôlé et quels sont les facteurs concernés pour assurer la production d’un isoforme CD45 particulier après l’activation de la cellule. Le CD45 est d’un intérêt immédiat et élevé pour deux raisons: premièrement, il régularise l’intensité de la réaction immunitaire dépendant de la cellule T et, deuxièmement, un épissage aberrant du pre-mRNA CD45 peut être associé à une prédisposition pour des maladies auto-immunitaires. Nous avons découvert que la Gfi1 peut influer sur l’épissage différentiel du pre-mRNA CD45, spécialement les isoformes contenant les exons 4 et 5. Il s’est avéré que la Gfi1 peut interagir avec un nouveau facteur d’épissage, le U2AF26, et que le Gfi1 aussi bien que le U2AF26 sont tous les deux requis pour un épissage alternatif approprié. À l’aide d’une approche minigène, nous avons pu mettre en évidence que le U2AF26 soutient l’exclusion de l'exon 5 CD45, possiblement en favorisant le recrutement de protéines régulatrices vers un silenceur d’épissage exonique à même le pre-mRNA CD45. Cette activité est contrebalancée par un Gfi1 qui mène à une expression favorable de l’isoforme CD45RB. Nos études ont démontré de plus qu’une perte de Gfi1 a un effet dramatique sur l’épissage alternatif du CD45 et il en résulte une perturbation de la capacité des cellules T à réagir à l’activation antigénique. (Voir figure 3)

Le complexe Miz-1/c-Myc dans l’hématopoïèse et la transformation maligne
(En collaboration avec Martin Eilers, Philipps-Universität Marburg, Allemagne)

La protéine c-Myc est un membre de la famille des phosphoprotéines nucléaires qui comprennent les c-, N- et L-Myc. Chacun des trois membres de la famille Myc joue un rôle clé dans la régulation de la croissance des cellules, la différenciation et la prolifération. Le gène c-Myc, par exemple, est induit au moyen de stimulation sérologique dans des cellules cultivées en tant que gène qui répond typiquement de façon hâtive et immédiate et qui exerce une partie de ses fonctions en conduisant les cellules à la phase-S. Dans bon nombre de cancers humains, les gènes de la famille Myc sont activés de manière transcriptionnelle soit par amplification des gènes ou par altérations chromosomiques spécifiques. Le gène c-Myc est exprimé dans un certain nombre de cellules hématopoïétiques matures et il contrôle principalement les étapes proliférantes, mais il a récemment été impliqué dans l’autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques par le groupe d’Andreas Trumpp, à Lausanne en Suisse. Tous les membres de la famille Myc contiennent un domaine de transactivation (TAD) à l’extrémité terminale aminée et une région basique directement suivie par un motif de type fermeture éclair à leucines hélice boucle-hélice (b-HLH-LZip) à l’extrémité carboxylique. À l’opposé de ses activités en tant que transactivateur transcriptionnel, le c-Myc a également été corrélé avec la transrépression des gènes cibles, mais les mécanismes sont moins bien compris. Il y a possibilité que la répression médiée du Myc soit le résultat d’une interférence avec les protéines liées à l’élément déclencheur (INR) qui fait partie du noyau promoteur. Dans un exemple appuyant ce modèle, le gène Myc interfère négativement avec la protéine POZ/BTB Miz-1, qui transregule l’expression du gène cible par le biais de la fixation au site inititiateur de transcription (INR). Cette transactivation est abrogée par une interaction directe avec c-Myc. Nous nous employons actuellement à générer différentes souris mutantes pour identifier le rôle que joue le complexe Miz-1/c-Myc durant la différenciation hématopoïétique et dans la transformation maligne des cellules immunitaires. (Voir figure 4)

Stem cells in hematopoiesis I Cancer in the hematopoietic system I Gfi1 and Gfi1b – chromatin modifiers I Regulation of alternative splicingMiz-1/c-Myc complex in hematopoiesis

Stem cells, self-renewal and lineage determination in hematopoiesis
To sustain a continuous generation of all blood and immune cells throughout the lifetime of an individual, a self-renewing pool of hematopoietic stem cells is required. However, these stem cells are not only capable of self-renewal, they also have the ability to differentiate and produce multipotent progenitors and a series of intermediate lineage committed progenitors that are able generate specific hematopoietic or immune cell lineages. During this differentiation process, the stem cells gradually loose their capacity of self-renewal, i.e. their «stemness», and acquire new phenotypes reflected by a higher degree of lineage commitment. The decision of HSCs or their more committed progeny for self-renewal or for differentiation is strictly controlled by both extrinsic and intrinsic mechanisms.

Cancer in the hematopoietic system
Hematopoietic differentiation is controlled by numerous signal transduction pathways that can be initiated by interleukins, lineage specific growth factors or their receptors and are relayed by cytoplasmic adaptor proteins, kinases or other latent cytoplasmic factors. Many of these signaling pathways eventually end in the nucleus where they activate transcription factors and chromatin regulators, which translate the signals into altered patterns of gene expression. Lymphoma and leukemia can be considered as a consequence of aberrant hematopoietic differentiation caused by the deregulation of particular constituents of these signaling pathways. Our group is interested to decode the altered genetic programming in hematopoietic malignancies and identify the underlying responsible mechanisms. To reach this goal, we study transcription factors that are the endpoint of hematopoietic signaling pathways and have been implicated in the emergence of leukemia and lymphoma. The transcription factors that are being investigated in our laboratory are the zinc finger proteins Gfi1 and Gfi1b, the basic helix-loop-helix protein c-Myc and one of its partners, the POZ/BTB domain transcription factor Miz-1. Interestingly, in murine lymphoma models, c-Myc and Gfi1 can act synergistically in the generation of lymphoid neoplasms and c-Myc is able to cooperate with a serine/threonine kinase called Pim-1 to accelerate tumor formation in mice. Thus, the Pim-1 kinase is also part of our research programme. (See Figure 1)

Gfi1 and Gfi1b – chromatin modifiers in hematopoietic cell differentiation
Gfi1 and Gfi1b are small zinc-finger proteins with a molecular mass of 55 and 37 KD, respectively. Both function in the nucleus as transcriptional silencers at precise steps during hematopoietic differentiation very likely by altering chromatin configuration. Whereas Gfi1 is implicated in the development of myeloid and lymphoid cells, Gfi1b governs the maturation of erythroid cells and megakaryocytes. To study the role of Gfi1 and its smaller homologue Gfi1b we have generated mouse mutants by gene targeting. Most surprising to us, we found that lack of Gfi1 provokes severe neutropenia and a developmental block in the granulocytic maturation pathway. This developmental block is intrinsic to the hematopoietic lineage since irradiated congenic mice transplanted with Gfi1 deficient bone marrow show the same lack of granulocyte differentiation suggesting that Gfi1 controls the commitment of progenitor cells for granulo-monocytic differentiation. Using Gfi1 deficient mice in further investigation, we were able to uncover roles for Gfi1 in T-cell differentiation, the innate immune response, and also in hematopoietic stem cells. In contrast to Gfi1, the related protein Gfi1b seems to be responsible for a correct erythroid and megakaryocytic maturation. Comparing the expression pattern and the functional implications of both proteins during hematopoiesis leaves the impression that both factors have been designed to fulfill similar tasks of hematopoietic cell differentiation in different cell lineages. How Gfi1 and Gfi1b act on the molecular level on chromatin to mediate their task in hematopoietic differentiation is currently under investigation in our group. http://www.chromatin-plasticity.org. (See Figure 2)

Regulation of alternative splicing by cooperation between Gfi1 and the splice factor U2AF26
Alternative splicing occurs when identical pre-mRNA molecules are spliced not only into one but into several different mature transcripts with different protein coding potential. It is estimated that up to 50% of all human genes are subject to alternative splicing. The potentially very large number of protein isoforms that can be generated by this process of alternative splicing represents a significant source of proteome diversity. Alternative splicing not only increases the number of proteins encoded by a given genome but also represents a regulatory process to control the expression of functionally diverse proteins from single genes. This functional diversity can vary with the developmental of differentiation stage of a cell or can depend on external stimuli. A paradigmatic example is the transmembrane tyrosin-phosphatase CD45 which is required for antigen dependent T-cell activation. The CD45 pre-mRNA undergoes alternative splicing to produce eight different isoforms in T-cells, depending on their developmental stage and activation status. How this process is controlled and which factors are involved to ensure the production of a particular CD45 isoform after T-cell activation has not been elucidated. CD45 is of immediate, high interest for two reasons: First, it regulates the intensity of the T-cell dependent immune response and second, aberrant splicing of CD45 pre-mRNA may be associated with a predisposition to auto-immune diseases. Whave discovered that Gfi1 can affect the differential splicing of CD45 pre-mRNA, especially the isoforms containing the exons 4 and 5. We found that Gfi1 can interact with a novel splice factor, U2AF26, and that both Gfi1 and U2AF26 are required for a proper CD45 alternative splicing. Using a minigene approach, we found that U2AF26 promotes exclusion of CD45 exon 5, possibly by promoting the recruitment of regulatory proteins to an exonic splicing silencer within the CD45 pre mRNA. This activity is counteracted by Gfi1 which leads to favored expression of CD45RB isoform. Our studies showed further that loss of Gfi1 had a dramatic effect on CD45 alternative splicing and resulted in an impaired ability of T-cells to respond to antigenic activation. (See Figure 3)

The Miz-1/c-Myc complex in hematopoiesis and malignant transformation
(In collaboration with Martin Eilers, Philipps-Universität Marburg, Germany)

The c-Myc protein is a member of a family of nuclear phosphoproteins that comprise c-, N- and L-Myc. All three Myc family members have key roles in the regulation of cell growth, differentiation and proliferation. The c-Myc gene for instance is induced by serum stimulation in cultured cells as a typical immediate early response gene and exerts part of its function by driving cells into S-phase. In a large number of human cancers Myc family genes are transcriptionally activated either by gene amplification or specific chromosomal alterations. The c-Myc gene is expressed in a number of mature hematopoietic cells and controls mainly proliferative steps but has recently been implicated in hematopoietic stem cell self-renewal by the group of Andreas Trumpp in Lausanne, Switzerland. All Myc family members contain a transactivation domain (TAD) at the amino terminal end and a basic region directly followed by a helix loop helix-leucine zipper motif (b-HLH-LZip) at its carboxy terminus. In contrast to its activities as a transcriptional transactivator, c-Myc has also been correlated with transrepression of target genes but the mechanisms are less well understood. One possibility is that Myc mediated repression is the result of an interference with proteins binding to the initiator element (INR) which part of the core promoter. In an example supporting this model, Myc negatively interferes with the POZ/BTB protein Miz-1, which transactivates target gene expression through INR binding. This transactivation is abrogated by a direct interaction with c-Myc. We are currently generating different mouse mutants to address the role of the Miz-1/c-Myc complex during hematopoietic differentiation and in malignant transformation of immune cells. (See Figure 4)

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