L’ostéopétrose est une maladie génétique caractérisée par une absence de résorption de l’os. Elle résulte d’un défaut de différenciation ou d’activité de l’ostéoclaste, cellule qui dérive de la lignée hématopoïétique. La caractérisation des mécanismes moléculaires responsables de l’ostéopétrose fourniront d’importantes informations au niveau de la différenciation de l’ostéoclaste. Une approche déterminante, afin de définir les bases moléculaires de ces processus de différenciation, repose sur une étude génétique de l’ostéopétrose afin de définir les gènes impliqués dans cette maladie. Nous prenons avantage pour cela de la mutation grey-lethal (gl), décrite chez la souris, qui montre un défaut de différenciation des ostéoclastes conduisant à un phénotype d’ostéopétrose. Ce phénotype est proche de la maladie infantile humaine, et comme elle, peut être guérie par transplantation de moelle osseuse.

L’objectif de ce projet est la caractérisation du gène responsable de la mutation grey-lethal (gl) et la détermination de son rôle dans la différenciation de l’ostéoclaste et l’établissement d’un phénotype d’ostéopétrose. A cette fin, le clonage par position du gène grey-lethal est en cours car cette approche est la plus adéquate et la plus sûre. La génération d’un ensemble de clones contigus couvrant la région du chromosome 10 incluant le locus gl, nous permettra d’isoler ce gène.

Trois approches sont développées en même temps.

1. Localisation génétique précise du gène grey-lethal 
Un croisement en retour entre la souris gl (Mus domesticus) et Mus spretus est en ce moment effectué.

Jusqu’à maintenant 460 animaux ont pu être obtenus. L’analyse de chaque ADN permet de déterminer l’origine génétique des gènes B-raf, c-fyn, c-ros localisés sur le chromosome 10 et proches du locus grey-lethal. De plus, les mêmes ADN ont été analysés en utilisant des oligonucléotides spécifiques de plusieurs microsatellites (Mit45, Mit55, 108, 215) appartenant au chromosome 10 et servant de marqueurs car ils sont polymorphiques entre les souches murines domesticus et spretus. Ainsi, nous avons pu localiser le gène grey-lethal dans une région couvrant 2,3 ± 1,3 centimorgans. Un second croisement avec Mus m. molossinus est actuellement analysé.

Au cours de cette analyse, nous avons montré des polymorphismes spécifiques du chromosome 10 qui porte la mutation grey-lethal. Les microsatellites D10 Mit55 et D10 Mit108 amplifient un fragment d’ADN différent chez les animaux homozygotes pour gl et les animaux sauvages. Ceci est une indication que nous sommes très proches de la région chromosomique où se situe le gène gl, ce qui facilitera grandement le clonage du gène.

2. Génération d’un contig spécifique du chromosome 10
Deux génothèques d’ADN de souris, (Princeton et MIT) construites dans un chromosome artificiel de levure (YAC), sont criblées en utilisant la réaction d’amplification avec la polymérase. Des oligonucléotides spécifiques du gène c-fyn ont été utilisés afin d’isoler un clone nous servant de point de départ à notre marche sur le chromosome 10 en direction du locus grey-lethal. De nouveaux oligonucléotides ont été définis et utilisés pour cribler de nouveau les deux génothèques de YACs. Ainsi, à chaque étape, nous générons des sondes spécifiques du chromosome 10, pouvant être très utiles dans la perspective de l’étude du génome de la souris. Cette marche chromosomique se poursuit présentement et nous avons aussi isolé plusieurs clones comprenant les polymorphismes que nous avons décrits précédemment. 

3. Caractérisation de la mutation gl au niveau cellulaire
Sachant que l’ostéoclaste est issu des précurseurs hématopoïétiques responsables de la formation des monocytes/macrophages, nous étudions les précurseurs de ces cellules chez le mutant gl. Des cultures in vitro ont montré une augmentation de certaines populations de ces précurseurs. Une diminution importante de la population des cellules B matures de la rate a aussi été observée. Des études complémentaires de reconstitution à long terme sont actuellement mises en oeuvre.